ANEXT安龄生物·细胞外囊泡分离技术

ANEXT安龄生物·细胞外囊泡分离技术

细胞外囊泡的分类

(相关资料图)

什么是细胞外囊泡？ 

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EV在复杂的体液环境中体积小、密度低、分布广，使得研究人员在分离和分析后获得高纯度EV极具挑战性。这也限制了它们的临床应用。现在已经开发了几种新技术和商业产品来隔离EV。这些基于利用EV物理特性的分离原理，例如它们的密度、质量和形状。此外，还可以根据EV的理化和生化特性进行分离，例如电荷、流体动力学、溶解度和表面特性（蛋白质）。已经开发了几种常规分离方法，每种方法都有自己的优点和缺点。因此，根据EV的不同特性，可以以单一或组合的方式进行分离。

1、超速离心

超速离心（UC）是最常用的方法，也是目前EVs分离的金标准。在这种方法中，EV被分离，因为它们的沉降系数与其他颗粒的沉降系数不同。简而言之，UC是一种差速离心方法，其中离心力逐渐增加，首先以2000-4000×g的低离心力去除死细胞和细胞碎片;去除凋亡囊泡、MV、生物聚合物等，浓度为10000-20000×g;并以100000-200000×g的高离心力沉淀外泌体。使用UC分离毛囊和脂肪组织间充质干细胞衍生的EV。在研究中，首先收集含有培养基的细胞，然后在2000×g和4°C下离心10分钟以除去细胞碎片，然后将上清液以10000×g离心30分钟。最后，使用第二上清液在以100000×g离心90分钟后获得EV。利用UC从前列腺癌细胞和正常前列腺上皮细胞中提取外泌体，他们开发了一种3D-SiO2多孔芯片用于小鼠肿瘤分期和前列腺癌的早期临床检测。然而，离心参数例如使用振荡桶或固定角度转子以及离心持续时间，会影响分离囊泡的产量和纯度。结果表明，适当延长离心时间可以提高外泌体中的蛋白质和RNA产量，而仅靠转速无法预测外泌体的造丸能力。 

此外，UC会由于高离心力而对囊泡造成机械损伤，从而导致囊泡与实底血管之间的碰撞。这会降低分离外泌体的纯度，并由于囊泡异质性导致存在一些污染物蛋白质聚集体。

2、密度梯度超速离心

密度梯度离心（DGC）是一种基于EV尺寸、形状、质量和密度的改进超速离心方法。在密度梯度溶液中，当每个颗粒的离心力与浮力平衡时，由于密度不同，不同的组分在从上到下的梯度中积累在不同位置。因此，外泌体可以与样品中的其他成分分离。通常，蔗糖或碘二醇用于产生密度梯度。使用差速离心和额外的Optiprep™密度梯度超速离心提取水蚤原始小胶质细胞释放的EV。使用质谱法测定了分离的EV的蛋白质含量，发现DGC的使用消除了污染物，并限制了分离过程中存在的蛋白质聚集体和其他膜颗粒的共分离效果。使用DGC从人类唾液中分离EV，并将其与从细胞培养上清液中分离的EV进行比较。他们发现唾液EV的体积和密度分别为±和/mL，而细胞EV的体积和密度分别为74±和/mL。因此，唾液EV的体积较低，密度较高。

DGC需要跨不同梯度的分离，并且需要时间在梯度中的每个点达到平衡。因此，此过程相对耗时且时间敏感，但操作相对简单。

3、体积排阻色谱

体积排阻色谱（SEC）是一种基于粒径差异的分离技术。它也被称为凝胶过滤。色谱柱中的固定相由多孔珠（例如，琼脂糖、琼脂糖、琼脂丙烯酸和Biogel P）组成。当添加样品时，大颗粒无法进入孔隙并被洗脱出来，在色谱柱中保留的时间较短。同时，小颗粒进入孔隙，其洗脱速率显着降低。因此，实现了分离。如何使用SEC从不同的生物体液中分离EV。注射器或带有过滤器的空柱可用于设置SEC，同时在注射器的尖端放置尼龙网。随后可以添加缓冲液以润湿过滤器并防止气泡。随后，可以加入所需体积的凝胶过滤基质、填充洗脱缓冲液、润湿，最后使用。使用SEC从人体滑液中分离EV，并证明SEC可以通过超速离心耗尽EV浓缩后残留的污染物。此外，使用高分辨率质谱分析，他们发现蛋白酶K成功去除纤连蛋白和其他细胞外蛋白。由于脂蛋白颗粒的存在，很难从血液中分离EV。因此，将SEC与密度缓冲相结合，将脂蛋白颗粒与EV分离，同时将脂蛋白颗粒的污染减少100倍，从而提高EV的纯度。比较了SEC和UC从尿液中提取外泌体方面，发现SEC在回收外泌体颗粒和蛋白质方面优于UC，提取的外泌体更多。相反，在UC过程中，发生破裂和不完全沉淀，导致外泌体蛋白回收率降低，外泌体颗粒明显损失。将SEC纯化的外泌体与和HCV29细胞系的外泌体进行比较，在共孵育后4-6小时显示出较高的内化能力。

因此，与用UC提取的EV相比，使用SEC提取的EV具有更高的纯度。然而，SEC在操作上更具挑战性，需要额外的设备。

4、超滤

超滤（UF）的原理基于分子大小。该过程类似于传统的过滤方法，因为较大的颗粒被过滤器保留，而较小的颗粒通过一个或多个具有不同孔径或MWCO（分子量截止值）的膜。切向流过滤（TFF）也基于这一原理，是UF的高级形式。使用TFF从微藻中分离EV，截止值为650、200和20nm。为了提高样品纯度和产量，评估了不同的技术参数和条件，以提高EVs的分离。发现优化的基于TFF的生物工艺适用于大规模生产。比较了UC和TFF从MDA-MB-231乳腺癌细胞培养物中分离EV的情况。发现TFF在产量和去除单个大分子和聚集体方面更胜一筹。开发了一种优化UF的方法，方法是引入μm过滤器和MWCO为10000 kDa的透析膜，以去除大于200nm的细胞外微泡。使用离心超滤和100kDa MWCO纳米膜过滤装置从支气管肺泡灌洗液中分离EVs，发现该过程提供的EV分布比UC和DGC更小，更均匀。与UC相比，UF和SEC将每毫升培养基回收小型EV的能力提高了约400倍。

然而，当使用UF时，膜容易堵塞和剪切力，这会在过滤过程中破坏EV。然而，操作更简单。

5、场流分馏

用于场流分馏的分离装置是一个薄而扁平的通道，高度为50–500μm。在垂直于样品流的方向上施加力场，随后聚焦在通道壁的一侧，其中颗粒由于其不同的尺寸而与壁保持不同的距离。离侧壁较远的较小颗粒在较大颗粒之前被洗脱。有不同类型的外部场，如电场、重力场、温度场和错流场，它们可用于根据其生物物理特性分离样品。其中，研究最广泛的是非对称流场分馏（AF4）中的错流场。AF4可用于从人血浆中的高密度脂蛋白（HDL）和脂蛋白颗粒（LDL）中分离EV，具有高纯度和重现性。此外，他们发现人EV在人血浆中的浓度高于等体积的配对血清样品，并且人血浆中EV量的个体差异与年龄和性别无关。最后，他们优化了AF4技术和样品制备工艺参数。使用流场-流分馏法根据永生化人类神经干细胞（HMSC）的不同流体动力学直径从中分离浓缩外泌体。采用流场流分级法根据尿外泌体的大小进行分离，发现前列腺癌患者的外泌体几乎是健康个体的两倍。

然而，在该方法中，分离过程中的样品量很小，因此不允许进行大规模的分离和提取。此外，还需要事先分馏和浓缩。然而，该技术具有很高的重现性和分辨率。

6、沉淀法

聚合物沉淀法涉及将相关生物流体与聚合物溶液混合，然后低速离心以促进外泌体沉淀并获得外泌体。加入不同分子量的50%聚乙二醇（PEG），使最终浓度达到6、8、10、12和15%PEG和75mM NaCl。在优化方法后，最终选择添加PEG6000和NaCl，以达到10%PEG和75mM NaCl的浓度。孵育8小时后，可除去大量牛血清蛋白。然而，研究表明，用PEG制备的EV样品仍可能保留一定比例的非EV相关分子。在SEC步骤之前使用PEG从细胞培养基中沉淀外泌体可以提高常规SEC方法的分辨率，因为PEG会沉淀可溶性蛋白质。此外，基于聚合物的沉淀与SEC（Pre-SEC）方法相结合可以帮助分离分泌EV亚型的单个细胞类型。如今，基于聚合物共沉淀的商用试剂盒可用于EV分离。使用miRCURY™外泌体分离试剂盒从血浆中获得丰富的EVs特异性miRNA。他们发现基于沉淀的方法不足以从血浆中纯化含有EVs的miRNA货物。虽然可以去除部分无囊泡miRNA，但无囊泡miRNA在该方法分离的血浆EV沉淀物中仍然占主导地位。比较了UC、PEG方法和两种商业试剂盒（Exoquick和PureExo）从健康供体血液中分离gDNA-EV的性能。他们发现PEG方法可以提高gDNA产量，降低成本和时间。

除了基于聚合物的沉淀外，基于电荷的沉淀还可用于EV分离。使用带正电荷的鱼精子蛋白诱导血清、唾液和细胞上清液中的EV沉淀。当使用35000Da PEG沉淀鱼精子蛋白时，促进了EV的重悬，并且沉淀EV的回收率比通过使用电荷超速离心获得的EV更有效。沉淀法避免了对昂贵设备的需求，适用于从小型生物样品中分离EV。使用硫酸铵进行盐析，从脱脂牛奶中分离EV，实现与UC相当的纯度和产量，而使用ExoQuick试剂盒分离的EV纯度较低。他们还验证了EV作为治疗载体的相关功能。

在沉淀方法中，聚合物的污染可能会降低纯度。虽然这些套件价格昂贵，但它们易于操作且随时可用。

7、微流体

通过微流控芯片对EV进行分离定量，具有样品体积小、检测速度快、多通道检测易于实现等优点而受到广泛关注。设计了一种基于膜的微流控平台，使用两个膜过滤器进行EV分离和计数，用于从血液中快速分离和定量EV。首次使用μm聚碳酸酯膜进行搅拌增强过滤以分离小型EV，分离率超过99%。氧化铝膜上的CD63免疫染色显示荧光标记的CD63+EVs，可在显微镜下计数。通过分析荧光斑点尺寸分布，可以估计单个EV的外泌体蛋白表达。创建了一个基于亲和捕获的微流体平台。它由两个微流体芯片组成：一个马蹄形口混合器（HOMM）单元和一个鱼陷阱形状的微过滤器单元（鱼陷阱），分别用于捕获和洗脱纯化。这些芯片可以组合使用或单独操作，EV的捕获、富集和释放可以在5分钟（100μL样品）内完成。开发了一种用于EV分离的微流体两相水系统（ATPS）。ATPS装置有三个入口和三个出口，形成两个两相水流界面层，以PEG和葡聚糖ATPS为微流控通道。该设备可以从EVs-蛋白质混合物中回收高达%的EV，并去除高达%的杂质。

通过微流体分离EV是近年来发展起来的一种相对较新的方法。由于自动化、低样品要求和程序的高通量性质，它逐渐引起研究人员的关注。但是，需要解决有关大规模应用的问题（降低制造和操作的复杂性）。

8、基于亲和力的方法

基于化学亲和力的EV分离已被广泛研究。基于亲和力的方法可分为两大类：目标EV捕获和非目标EV捕获。为了靶向捕获EV，使用高亲和力抗体、适配体和肽的组合靶向EV表面的各种生物分子。同时，非靶向捕获使用脂质探针、磷脂酰丝氨酸（PS）和TiO。基于EV表面脂质的高亲和力提取EV。使用传统的球形免疫磁珠会导致较低的浓度和回收效率，因为磁珠的表面光滑和刚性界面修饰。一种使用脂质标记和磁珠的新技术，首先插入脂质基序DSPE-PEG1000-TCO，该基序标记血浆中的EV，然后使用生物正交点击化学将TCO标记的EV固定在四嗪（TZ）接枝微球（小贴）上。然后通过离心分离小贴纸上的EV，最后使用逆转录数字PCR（RT-dPCR）分析EV中的mRNA。与基于免疫亲和力的EVs标记不同，基于免疫亲和的EVs标记受EVs表面特异性抗原（CD63、CD81、CD9）数量的限制，基于脂质的EVs标记物独立于EVs表面抗原。这些标志物与RT-dPCR同时组合可以量化尤文肉瘤和胰腺癌的致癌变化，证明其在监测治疗反应和疾病进展方面具有潜在的临床价值。开发了免疫磁性刺猬颗粒（IMHP）来捕获和释放外泌体。这些颗粒用于从MCF-7细胞中捕获外泌体，捕获率高达%。与通过UC获得的外泌体相比，通过该方法获得的外泌体保持了其结构完整性并显示出良好的生物活性。利用了富含磷脂酰丝氨酸的外泌体表面和SiO上的固定肽配体2微球诱导特异性相互作用并分离外泌体，并使用该方法从血清中分离外泌体。

使用DNA定向固定化（DDI）策略，通过固定与磁性颗粒上的囊泡结合的抗CD63抗体来分离EV。也就是说，使用互补寡核苷酸对表面和抗体进行功能化，通过双链DNA接头的DNAse I催化酶促切割释放EV。传统方法基于通过加热或超声波破坏抗原抗体和改变其物理性质，用有机溶剂、碱和其他化学方法处理可能会损坏EV。然而，所提出的可逆DNA连接可以允许在酶切后释放EV，克服这个问题，同时增强对抗CD63抗体的亲和力。基于与EVs表面的静电相互作用、物理吸附和生物识别相结合，制备了一种由乳铁蛋白偶联树枝状修饰的磁性纳米颗粒组成的嵌合纳米复合材料，无需离心和抗体亲和力即可分离EV。EV可以在30分钟内从细胞培养物和临床标本中分离出来，但无法与其他类型的EV区分开来。

9、其他分离方法

使用电泳迁移和多孔膜从等离子体中分离EV，多孔膜由两个电极之间并列的膜形成的三个流道组成。样品在切向流中水平移动，并在施加的电压下垂直迁移。然而，尺寸>30nm的带负电的EV无法通过孔并积聚在膜上，随后用PBS洗涤膜以收集EV。使用琼脂糖凝胶电泳从血浆脂蛋白中分离EV，该方法基于EV大小和zeta电位的差异。通过电泳回收的EV的形态与典型EV的形态一致。Naohiro一种使用阴离子交换制备外泌体的有效方法，其中细胞上清液首先通过μm保留滤膜分离，然后使用阴离子交换柱层洗脱EV。该方法被证明最适合制备符合GMP标准的EV以供临床使用。

综上所述，目前EV分离的方法多种多样。但是，每种方法都有其优点和缺点。无论采用何种方法，重要的是考虑分离的EV是否完整，以及是否可以通过结合不同的技术来优化分离和纯化。因此，可以有效地分离高纯度EV，同时去除不需要的物质，确保安全并最大限度地降低成本以实现大规模运营。

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